Избор на биофилтърна среда за Largemouth Bass- Характеристики на биофилма и производителност на растеж
Лаврак (Microopterus salmoides), известен още като калифорнийски бас, принадлежи към Actinopterygii, Perciformes, Centralarchidae, Micropterus. Той е роден в Калифорния, САЩ, и има предимства като бърз растеж, прекрасен вкус, богата хранителна стойност и висока икономическа стойност. Той се превърна в един от важните видове сладководни аквакултури в Китай. През последните години, на фона на трансформацията и модернизацията на рибарството и енергичното развитие на цифровия и интелигентен риболов, постепенно се появи индустриализирана рециркулационна аквакултура. Режимът на отглеждане на аквакултури на лаврак също преминава от традиционна езерна култура към екологичен и ефективен режим на рециркулираща аквакултура. Рециркулационната аквакултура има предимства като пестене на вода и земя, висока гъстота на отглеждане и удобно управление. Чрез физични, биологични, химични методи и оборудване, твърдите суспендирани твърди частици и вредните вещества във водното тяло се отстраняват или превръщат в безвредни вещества, така че качеството на водата да отговаря на нормалните нужди за растеж на култивираните видове, като по този начин се осъществява рециклирането на водата при условия на високо-гъстота на аквакултурата. Той е постигнал добри икономически ползи при множество култивирани видове.
Понастоящем изследванията върху рециркулиращите аквакултури на лаврака се фокусират главно върху възпроизвеждането, храненето на фуражите, подбора на щамове, прецизното хранене, промените във водната среда и качеството на храненето. Изследванията върху индустриализирани рециркулиращи аквакултури на закрито на едроуст лаврак се фокусират главно върху отглеждането на млади риби с големи-размери, а отглеждането на възрастни риби в пълен-цикъл не е широко насърчавано. Основното предизвикателство, пред което са изправени рециркулиращите аквакултури на едроуст лаврак, е поддържането на добра водна среда при условия на висока-гъстота, за да се осигури нормален растеж на култивираните видове. Пречистването на водата е в основата на рециркулиращата аквакултура, а ефективната биофилтърна среда за пречистване на вода е в основата на системата за пречистване на водата. Въпреки че има много доклади за пречистване на водата чрез биофилтърни среди, липсват доклади конкретно за индустриализирана рециркулираща аквакултура на едър лаврак, особено по отношение на скрининга на ефективна биофилтърна среда за пречистване на водата, структурата на микробната общност на биофилмите върху различни биофилтърни среди, ефектите от третирането и въздействията върху растежа на култивираните видове. Бяха избрани три вида биофилтърни среди, сред които квадратната гъба и биофилтърната среда с кипящ слой са с ниска-цена и лесни за работа, и са били широко използвани в пречистването на опашната вода в аквакултурите; Mutag Biochip 30 (съкратено като Biochip) е нов тип биофилтърна среда, която се появи през последните години, с предимства като устойчивост на удар и дълъг експлоатационен живот, но ефектите от нейното практическо приложение не са докладвани. За тази цел беше използвана 16S rDNA технология за секвениране с висока -пропускливост, за да се анализира ситуацията на образуване на биофилм на трите биофилтърни среди за пречистване на водата, като едновременно с това се анализира ситуацията на растеж на дебелия лаврак, за да се отсеят практичните биофилтърни среди за третиране на вода и да се осигури ефективна среда за третиране на вода за индустриализирана рециркулираща аквакултура за голям лаврак.
1. Материали и методи
1.1 Тестови материали
Избраните за този тест биофилтърни среди бяхаквадратна гъба, Биочип, итопка с кипящ слой, както е показано вФигура 1. Квадратният гъбен материал е полиуретан, оформен като куб с дължина на страната 2,0 cm, специфична повърхност (3,2~3,5)×10⁴ m²/m³. Материалът на Biochip е полиетилен, оформен като кръг с диаметър 3,0 cm, дебелина около 0,11 cm, специфична повърхност 5,5×10³ m²/m³. Материалът на топката с кипящ слой е полиетилен, ефективна специфична повърхност 500~800 m²/m³.
1.2 Експериментално групиране
Групата за третиране на среда с биофилтър с квадратна гъба беше зададена като група T1, съответният биофилм на средата беше означен с B1, а съответната вода от аквакултури беше означена с W1; групата за обработка на биофилтърна среда Biochip беше зададена като група T2, съответният биофилм на средата беше означен с B2, а съответната вода от аквакултури беше означена с W2; групата за третиране на среда с биофилтър с топка в кипящ слой беше зададена като група Т3, съответният биофилм от среда беше означен с B3, а съответната вода от аквакултури беше означена с W3.
1.3 Система за аквакултури
Експериментът е проведен в рециркулираща система за аквакултури в Balidian Comprehensive Experimental Base на Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries.Имаше общо 9 резервоара за култура, обем 500 L, ефективен воден обем 350 L. Биофилтърният резервоар беше направен от пластмасов аквариум с размери 80 cm дълъг, 50 cm широк и 50 cm висок, обем 200 L, ефективен воден обем 120 L. Резервоарът за култура и резервоарът за биофилтър бяха свързани с водна помпа, за да се образува вътрешна циркулация, скорост на потока 3~4 L/min, с аерация за оксигенация, разтворен във вода кислород се поддържаше над 5 mg/L. Биофилтърната среда беше групирана на случаен принцип, всеки тип биофилтърна среда имаше 3 повторения, всеки биофилтърен резервоар беше зареден с 2,0 kg биофилтърна среда, като едновременно с това беше суспендиран бавно{7}}източник на въглерод. По време на периода на култивиране на биофилма 10% от водата се сменя ежедневно.Първоначални показатели за качество на водата: Общ азот (TN) 9,41 mg/L, Общ фосфор (TP) 1,02 mg/L, Амонячен азот (TAN) 1,26 mg/L, Нитритен азот (NO₂⁻-N) 0,04 mg/L, Перманганатен индекс (CODₘₙ) 3,73 mg/L.
1.4 Тест за управление на рибата и културата
Лавракът е използван като култивиран вид. Преди началото на теста те бяха аклиматизирани в рециркулиращата вода в продължение на 7 дни.Тестът е проведен от 11 август 2022 г. до 22 септември 2022 г. и е с продължителност 42 дни. Лаврак без повърхностни наранявания, здрав и жив, бяха избрани за групиране, 60 риби бяха заредени във всеки аквариум с култура, хранени два пъти дневно, часовете за хранене бяха 07:00 сутринта и 16:00 следобед, дневното количество за хранене представляваше около 1,0%~1,5% от общата телесна маса на рибата. Първоначалната телесна маса на тестовата риба е (20,46 ± 0,46) g.
1.5 Вземане на проби
Водни проби от биофилтърния резервоар се събират на всеки 2 дни, като се записват показатели като температура на водата, разтворен кислород, pH стойност и се измерва амонячен азот и нитритен азот. Записват се количеството на хранене, телесната маса на рибата в началото и в края на експеримента и степента на оцеляване. След експеримента, 1 L вода от всеки резервоар за култура се събира с помощта на стерилни торбички за събиране на вода, филтрира се през 0,22 µm филтърна мембрана и се съхранява във фризер при -80 градуса за по-късна употреба. Проби от биофилтърна среда от 0,5 g бяха взети асептично от всеки биофилтърен резервоар, съхранявани в стерилизирана дестилирана вода, разклатени енергично, за да се изгонят микроорганизмите от повърхността на биофилма, след това филтрирани през 0,22 µm филтърна мембрана и съхранени във фризер при -80 градуса за по-късна употреба.
1.6 Методи за измерване
1.6.1 Измерване на качеството на водата
Температурата на водата, разтвореният кислород и стойността на pH бяха открити с помощта на aПортативен анализатор за качество на водата HACH Hq40d. Концентрацията на амонячен азот се измерва с помощта на спектрофотометричния метод на реагента на Nessler. Концентрацията на нитритен азот се открива с помощта на спектрофотометричен метод на солна киселина нафтилетилендиамин.
1.6.2 Измерване на ефективността на аквакултурите
Формулите за изчисляване на скоростта на наддаване на тегло, коефициента на преобразуване на храната и процента на оцеляване на рибите са както следва.
l Скорост на наддаване на тегло= (Крайна телесна маса на риба - Първоначална телесна маса на риба) / Първоначална телесна маса × 100%;
l Коефициент на конверсия на фуража= Консумация на фураж / наддаване на тегло;
l Степен на оцеляване= (Брой риби в края на експеримента / Първоначален брой риби в началото на експеримента) × 100%.
1.6.3 Микробно високо{1}}пропускателно секвениране
Бактериалната ДНК се екстрахира от вода и биофилм с помощта на комплект за екстракция на бактериална ДНК (OMEGA Biotech, САЩ). Специфични праймери 338F (5'–ACTCTACGGGAGGCAGCAG–3') и 806R (5'–GGACTACHVGGGTWTCTAAT–3') бяха използвани за амплифициране на V3 и V4 регионите на бактериалната 16S rDNA. PCR използва реакционната система TransGen AP221-02: 4 µL от 5×FastPfu буфер, 2 µL от 2,5 mmol/L dNTPs, 0,4 µL от FastPfu полимераза, 0,8 µL всеки от 5 µmol/L предни и обратни праймери, 0,2 µL от BSA, 10 ng от ДНК матрица, допълнена с ddH2O до 20 µL. Условия на PCR реакцията: 95 градуса за 3 минути; 95 градуса за 30 секунди, 53 градуса за 45 секунди, 72 градуса за 1 минута, 28 цикъла; 72 градуса удължаване за 10 минути. PCR амплификацията се извършва на PCR реакционен инструмент 9700 (Applied Biosystems® GeneAmp®, САЩ). PCR продуктите се пречистват с помощта на Beads и след това се подлагат на секвениране. Секвенирането е възложено на Shanghai Majorbio BioPharm Technology Co., Ltd.
1.6.4 Анализ на микробното разнообразие
Суровите данни, получени от секвенирането, първо бяха сплайсирани, последвано от филтриране за контрол на качеството на качеството на четене и ефекта на снаждане и корекция на посоката на секвенцията, което доведе до оптимизирани данни. След нормализиране на окончателно получените Чисти данни, OTU (Оперативни таксономични единици) клъстерен анализ и таксономичен анализ бяха извършени при 97% сходство. Хистограмите на пробите бяха начертани с помощта на Excel, а топлинните карти бяха начертани с помощта на облачната платформа Majorbio.
1.7 Анализ на данни
Статистическият софтуер SPSS 16.0 беше използван за анализ на значимостта на разликите, а методът на Дънкан за анализ на дисперсията (ANOVA) беше използван за множество сравнения.
2. Резултати и анализ
2.1 Време за образуване на биофилм от различни биофилтърни среди
Както е показано вФигура 2,при естествени условия на образуване на биофилм, съдържанието на амонячен азот във водата на биофилтърния резервоар показва тенденция на бързо нарастване, последвано от постепенно намаляване.Съдържанието на амонячен азотвъв водата на биофилтърния резервоар, съответстващ на квадратната гъба, достигна своя пик на 17 дни, при 8,13 mg/L, след което постепенно намаля,достигайки най-ниската си стойност на 41 дни, след което остава около 0,20 mg/L, което показва, чевремето за образуване на биофилм за квадратната гъба беше около 17 дни. Промените в съдържанието на амонячен азот във водата на резервоарите за биофилтри, съответстващи на Biochip и топката с кипящ слой, бяха основно еднакви, показвайки колебания в промените. Пикът на амонячен азот се появява на 21-ия ден, съответно при 7,88 mg/L и 7,57 mg/L, което показва, чевремето за образуване на биофилм за Biochip и биофилтърната среда в кипящ слой е около 21 дни. Съдържанието на амонячен азотв биофилтърните резервоари, съответстващи натези две медии паднаха до най-ниското ниво съответно на 43 дни и 45 дни.
2.2 Промени в стойността на pH на водата в различни резервоари за култури
отФигура 3, може да се види, че началната стойност на рН на културалната вода е 7,3. С удължаването на времето за култивиране рН стойността на водата във всеки резервоар за култивиране показва низходяща тенденция. След 12 дни стойността на рН на всички резервоари с култури беше по-ниска от 6,0, което е неблагоприятно за растежа на култивираните видове.Следователно, след 12 дни образуване на биофилм, трябва да се обърне внимание на регулирането на рН стойността на водата от резервоара за култура.
2.3 Анализ на състава на микробната общност върху биофилми от различни биофилтриращи среди и във вода
2.3.1 Състав на микробната общност на ниво тип
Както е показано вФигура 4,на ниво тип, доминиращите бактерии върху биофилмите на трите биофилтърни среди бяха едни и същи, като всички бяха Proteobacteria, Actinobacteriota, Bacteroidota и Chloroflexi. Тяхното комбинирано относително изобилие е съответно 68,96%, 64,74% и 65,45%. Доминиращите бактерии в съответната културална вода са различни. Доминиращата бактерия в W1 е Actinobacteriota, с относително изобилие от 64,66%. Доминиращите бактерии в W2 и W3 бяха Proteobacteria, с относително изобилие съответно от 34,93% и 50,10%.
Фигура. 4 Състав на общността на бактерии в различен биофилм и вода на ниво тип
2.3.2 Състав на микробната общност на семейно ниво
Както е показано вФигура 5, върху биофилмите на трите среди, около 48% от бактериите са бактериални общности с относително изобилие по-малко от 3%. Доминиращите бактерии от B1 и B2 са едни и същи, като и двете са Xanthomonadaceae, с относително изобилие съответно от 11,64% и 9,16%; доминиращата бактерия на B3 беше JG30-KF-CM45, с относително изобилие от 10,54%. Доминиращите бактерии в културалната вода са различни от тези в биофилтърната среда. Microbacteriaceae е абсолютната доминираща бактерия в W1, с относително изобилие от 62,10%; доминиращите бактерии в W2, освен Microbacteriaceae (13,82%), също включват определен дял от Rhizobiales (8,57%); доминиращата бактерия в W3 е Rhizobiales, с относително изобилие от 38,94%, следвана от Flavobacteriaceae, с относително изобилие от 15,89%.
Бяха преброени първите 50 вида на ниво род. След обработка на числените стойности, промените в изобилието на различните видове в пробите бяха показани чрез цветовия градиент на цветните блокове. Резултатите са показани вФигура 6. Leifsonia е доминиращата бактерия в W1, с относително изобилие от 56,16%; доминиращите бактерии в W2 са Leifsonia (10,30%) и Rhizobiales_Incertae_Sedis (8,47%); доминиращата бактерия в W3 е Rhizobiales_Incertae_Sedis, с относително изобилие от 38,92%. Сред разпознаваемите бактерии върху биофилмите, Thermomonas е доминиращият род в B1, с относително изобилие от 4,71%; доминиращите родове в B2 и B3 са Nitrospira, с относително изобилие съответно от 4,41% и 2,70%.
Фигура. 5 Състав на общността на бактерии в различен биофилми вода на ниво семейство
Фигура. 6 Топлинна карта на състава на бактериалната общност в различен биофилм и вода на ниво род
2.4 -Анализ на разнообразието на микробните общности върху биофилми от различни биофилтриращи среди и във вода
Както е показано вТаблица 1, индексът на Шанън на микробните общности върху биофилмите от различни среди е по-голям от този на съответната културална вода, докато индексът на Симпсън е обратното. Анализирайки съответната културална вода, индексът Шанън на бактериалната общност на W2 е най-високият, значително по-висок от този на W1 и W3, докато индексът на Симпсън е значително по-нисък от този на W1 и W3, което показва, че неговото -разнообразие е най-високо. За разлика от -разнообразието на културалната вода, въпреки че индексът на Шанън на бактериалната микробна общност в средата B2 беше най-големият, а индексът на Симпсън беше най-малкият, нямаше значителна разлика между трите биофилтърни среди. Покритието на последователността на всички проби беше над 0,990, което показва, че дълбочината на последователността може да отразява истинското ниво на пробите.
2.5 Ефекти на различни биофилтриращи среди върху растежа на едроустия лаврак
Таблица 2показва ситуацията на растеж на лаврака в различните групи биофилтриращи среди. След 44 дни култивиране, крайната телесна маса и скоростта на наддаване на тегло на едроуст лаврак в групата с култивирана квадратна гъба са значително по-високи от тези в групите с топка с кипящ слой и биочип, а коефициентът на преобразуване на храната е значително по-нисък от този на другите групи. Степента на оцеляване на едроустия лаврак във всяка група е над 97%, без значителна разлика между групите.
3. Заключение и дискусия
3.1 Време за образуване на биофилм от различни биофилтърни среди
Биофилмите се прикрепят към повърхността на биофилтърната среда. Материалът, структурата и специфичната повърхност на биофилтърната среда са основните фактори, влияещи върху образуването на биофилм. Има два общи метода за култивиране на биофилм: методът за образуване на естествен биофилм и методът за образуване на инокулиран биофилм. Различните методи за образуване на биофилм влияят на времето за узряване на биофилма. Hu Xiaobing и др. използва четири различни метода за образуване на биофилм и резултатите показват, че при използване на методи като добавяне на хитозан, железни йони и инокулиране с изхвърлена утайка за образуване на биофилм, времето за узряване на биофилма е по-кратко от това на метода за образуване на естествен биофилм. Въпреки че добавянето на полезни микроорганизми или активни вещества може да съкрати времето за образуване на биофилм, има проблеми като трудност при получаване на инокулум, сложна конструкция на процеса и висока цена. Guan Min et al., при условия на ниско съдържание на органични вещества, директно използваха сурова вода за образуване на биофилм и биофилтърният резервоар успешно стартира чрез образуване на естествен биофилм след около 38 дни. Този резултат от изследването е подобен на резултатите от това проучване. Резултатите от това проучване показват, че при същите условия за образуване на биофилм, времето за образуване на биофилм на квадратната гъба е по-кратко от това на другите две биофилтърни среди. Това може да е свързано с голямата специфична повърхност, силната хидрофилност и лекотата на закрепване на биофилма на квадратната гъба. Специфичната повърхност на квадратната гъба е 32 000 ~ 35 000 m²/m³, много по-голяма от другите две среди. Освен това, материалът на квадратната гъба е полиуретан, който се разширява, когато е изложен на вода, има висока хидрофилност и благоприятства прикрепването и растежа на микроорганизми във водата. Резултатите от изследването на Li Yong et al. показаха също, че производителността-при стартиране и ефективността на отстраняване на амонячен азот на полиуретанова гъба са по-добри от тези на полипропилен, което е в съответствие с резултатите от това проучване. Освен това, в това проучване, специфичната повърхностна площ на биофилтърната среда Biochip беше до 5500 m²/m³, много по-голяма от тази на биофилтърната среда с кипящ слой, но времето за образуване на биофилм беше основно същото като това на сферичната среда с кипящ слой. Това може да е свързано с размера на порите. Някои проучвания посочват, че вътрешният пространствен мащаб на биофилтърната среда влияе върху растежа на биофилмите. Въпреки че някои биофилтърни среди имат голяма специфична повърхност, порите им са фини и размерът на порите е много по-малък от дебелината на зрелия биофилм, което лесно може да доведе до запушване на порите, което затруднява биофилма в порите да достигне максимално натрупване. Порите на Biochip са малки, което води до по-бавен растеж на биофилма и по-дълго време за образуване на биофилм.
3.2 Състав на микробната общност на биофилтърна среда и културална вода
В това изследване доминиращите бактерии върху биофилтърната среда и в съответната културална вода са различни. Индексът на Шанън на биофилмите върху биофилтърната среда е по-голям от този на съответната културална вода, което показва, че биофилтърната среда има ефект на обогатяване на микроорганизми. Това е в съответствие с резултатите от изследването на Hu Gaoyu et al. Има много фактори, влияещи върху структурата на микробната общност, като тип носител, дълбочина на филтъра, соленост, концентрация на органична материя и др. Една и съща биофилтърна среда, при различни условия на култура, ще има различни микробни общности върху биофилма. Авторът веднъж е изследвал ситуацията на образуване на биофилм на биофилтърна среда с топка в кипящ слой в рециркулираща система за аквакултури за гигантска сладководна скарида (Macrobrachium rosenbergii). Резултатите показаха, че доминиращият тип върху неговия биофилм е Firmicutes, докато в това изследване доминиращият тип върху биофилма с топка с кипящ слой е Proteobacteria. Основната причина за тази разлика може да са различните среди на аквакултури. Трите биофилтърни среди, използвани в това изследване, имат еднакви първоначални условия за култивиране на биофилми. Възможно е поради различните физически характеристики на средата дебелината на образувания биофилм и вътрешната среда също да са различни, което води до различия в микробните общности. Следователно разликата в носителите е основната причина за различията в микробните общности. Освен това, по време на процеса на аквакултура, водната среда и микробната общност си влияят взаимно. Причините за разликите в микробните общности може да са свързани с фактори на околната среда. Например, изследванията на Юан Куйлин показват, че общият брой на хетеротрофните бактерии в тялото; Fan Tingyu и др. смята, че стойността на pH може значително да повлияе на общото съдържание на азот във водата и играе ключова роля в разпространението на водните бактериални общности във вътрешните речни участъци. Амонячният азот, общият фосфор и хлорофилът а също влияят в различна степен върху състава на бактериалните общности във водния обект. Факторите на околната среда, причиняващи разликите в състава на микробната общност в това проучване, все още се нуждаят от допълнително потвърждение.
3.3 Ефекти на различни биофилтриращи среди върху растежа на едроустия лаврак
От резултатите от растежа, лавракът в групата с квадратна гъба расте най-бързо, със скорост на наддаване на тегло, значително по-висока от тази на другите две среди, и най-нисък коефициент на преобразуване на храната. Това е в съответствие с резултатите от предишни изследвания. В това проучване образуването на биофилм и аквакултурата се провеждат едновременно. Съдейки по времето на образуване на биофилма, биофилмът с квадратна гъба узрява по-рано и след узряването на биофилма концентрациите на амонячен азот и нитритен азот във водата винаги са по-ниски от тези на другите две среди. Освен това квадратната гъба има определен капацитет на филтриране, съдържанието на твърди суспендирани твърди вещества във водата за култура е по-ниско и водата е относително бистра. По-добрият растеж на лаврака в групата на квадратните гъби може да е свързан с доброто качество на водата. Въпреки това, пречистващите ефекти на средата с квадратна гъба върху общия азот, общия фосфор и перманганатния индекс във водата се нуждаят от допълнително проучване. Струва си да се отбележи, че по време на експеримента стойността на рН показва обща низходяща тенденция. След 12 дни култивиране стойността на pH на всички резервоари за култивиране е по-малка от 6,0, което е в съответствие с резултатите от изследването на Zhang Long et al. Намаляването на стойността на pH се дължи на факта, че голям брой водородни йони се произвеждат по време на процеса на култивиране на биофилма, което води до намаляване на стойността на pH на водата. Следователно, по време на процеса на образуване на биофилм, е необходимо незабавно да се коригира pH стойността на водата в резервоара за култура, за да се гарантира, че тя е в нормалния диапазон на растеж на култивираните видове. Като се имат предвид икономическите разходи, пазарната цена на квадратната гъба е 70~100 RMB/kg, а цената й е между другите две биофилтърни среди. В комбинация с резултатите от растежа, в краткосрочен план, квадратната гъба е сравнително практична биофилтърна среда за пречистване на водата за рециркулационни аквакултури. Квадратната гъба обаче има слаба издръжливост и кратък експлоатационен живот. Неговите дългосрочни -ефекти от употреба и ефектите върху аквакултурите се нуждаят от допълнителна проверка.
В обобщение,при естествени условия на образуване на биофилм, биофилтърната среда с квадратна гъба има най-краткото време за образуване на биофилм, умерена цена, а крайната телесна маса и скоростта на наддаване на тегло на едроуста гъба в групата с квадратна гъба са значително по-високи от тези на другите две биофилтърни среди. В краткосрочен план това е относително практична биофилтърна среда за пречистване на вода за рециркулационни аквакултури.